Die Gemäldegalerie besitzt eine der weltweit bedeutendsten Sammlungen europäischer Malerei vom 13. bis zum 18. Jahrhundert, die seit dem Gründungsjahr 1830 systematisch aufgebaut und vervollständigt wurde. Meisterwerke aus allen kunsthistorischen Epochen, darunter Gemälde von van Eyck, Bruegel, Dürer, Raffael, Tizian, Caravaggio, Rubens, Rembrandt und Vermeer sind hier ausgestellt.

Der Neubau am Kulturforum bietet eine Ausstellungsfläche von rund 7 000 Quadratmetern. Ein fast 2 km langer Rundgang mit 72 Sälen und Kabinetten führt durch einzelne Kunstlandschaften und Epochen. Sammlungsschwerpunkte bilden die deutsche und italienische Malerei des 13. bis 16. Jahrhunderts und die niederländische Malerei des 15. bis 16. Jahrhunderts.

Die altdeutsche Malerei der Spätgotik und Renaissance ist durch namhafte Künstler wie Konrad Witz, Albrecht Dürer, Baldung Grien, Cranach und Holbein vertreten. Der Saal mit Rembrandt-Gemälden ist durch seine zentrale Lage im Museum hervorgehoben. Die Sammlung gehört mit 16 Werken des Künstlers zu den größten und qualitätvollsten der Welt.

Sie wird flankiert von weiteren Gemälden der holländischen und flämischen Malerei des 17. Jahrhunderts. Bildnisse, Genrebilder, Interieurs, Landschaften und Stillleben zeugen von der Spezialisierung der Künstler auf bestimmte Themen.

In sechs Räumen wird die italienische, französische, deutsche und englische Malerei des 18. Jahrhunderts präsentiert. Die reiche Bildersammlung enthält Werke von Canaletto, Watteau, Pesne und Gainsborough. In der Hauptgalerie sind rund 1 000 Meisterwerke ausgestellt. Sie wird durch eine Studiengalerie im Sockelgeschoss mit etwa 400 Bildern ergänzt.