La Gemäldegalerie possède l'une des plus importantes collections au monde de peinture européenne du 13e au 18e siècle, qui a été systématiquement constituée et complétée depuis 1830, année de sa fondation. Des chefs-d'œuvre de toutes les époques de l'histoire de l'art, dont des tableaux de van Eyck, Bruegel, Dürer, Raphaël, Titien, Caravage, Rubens, Rembrandt et Vermeer y sont exposés.

Le nouveau bâtiment du Kulturforum offre une surface d'exposition d'environ 7000 mètres carrés. Un parcours de près de 2 km, composé de 72 salles et cabinets, permet de découvrir différents paysages et époques artistiques. Les points forts de la collection sont la peinture allemande et italienne du 13e au 16e siècle et la peinture néerlandaise du 15e au 16e siècle.

La peinture allemande ancienne de la fin du gothique et de la Renaissance est représentée par des artistes de renom tels que Konrad Witz, Albrecht Dürer, Baldung Grien, Cranach et Holbein. La salle des peintures de Rembrandt est mise en valeur par sa position centrale dans le musée. Avec 16 œuvres de l'artiste, la collection est l'une des plus importantes et des plus qualitatives au monde.

Elle est flanquée d'autres tableaux de la peinture hollandaise et flamande du 17e siècle. Portraits, tableaux de genre, intérieurs, paysages et natures mortes témoignent de la spécialisation des artistes dans certains thèmes.

La peinture italienne, française, allemande et anglaise du 18e siècle est présentée dans six salles. La riche collection de tableaux comprend des œuvres de Canaletto, Watteau, Pesne et Gainsborough. Environ 1000 chefs-d'œuvre sont exposés dans la galerie principale. Elle est complétée par une galerie d'étude située au niveau du socle et contenant environ 400 tableaux.