La Gemäldegalerie possiede la più importante collezione al mondo di pittura europea dal XIII al XVIII secolo, con capolavori di tutte le epoche storiche, tra cui dipinti di grandi maestri quali van Eyck, Bruegel, Dürer, Raffaello, Tiziano, Caravaggio, Rubens, Rembrandt e Vermeer.
Inserito nel contesto del Kulturforum, l'edificio della Gemäldegalerie dispone di una superficie espositiva di 7.000 metri quadrati. Un percorso di quasi due chilometri di lunghezza che si sviluppa su 72 sale conduce attraverso le diverse epoche e i diversi ambienti artistici. I nuclei fondamentali della collezione sono costituiti dalla pittura tedesca e italiana dal XIII al XVI secolo e dalla pittura olandese dal XV al XVII secolo. La pittura tedesca tardo-gotica e rinascimentale è rappresentata da artisti di grande rilieivo, quali Konrad Witz, Albrecht Dürer, Baldung Grien, Cranach e Holbein. Sottolineata dalla sua collocazione centrale all'interno dell'edificio, la sala con i dipinti di Rembradt è il cuore del museo. Con i suoi 16 dipinti, infatti, la collezione di opere dell'artista olandese è una delle più ampie e qualitativamente più importanti al mondo. Diversi altri dipinti olandesi e fiamminghi del XVII secolo affiancano la sala di Rembrandt.
Nella galleria centrale sono esposti circa 1000 capolavori, cui si aggiungono i 400 dipinti della Galleria di Studi che si trova al piano interrato.